附件：基孔肯雅病毒核酸檢測試劑技術(shù)審評要點（試行）（2025年第17號）.doc

基孔肯雅病毒核酸檢測試劑技術(shù)審評要點
（試行）

本審評要點旨在指導(dǎo)注冊申請人開展基孔肯雅病毒核酸檢測試劑的設(shè)計開發(fā)工作，準(zhǔn)備產(chǎn)品注冊申報資料，同時也為技術(shù)審評部門提供參考。

本審評要點是對基孔肯雅病毒核酸檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實和細(xì)化。

一、適用范圍

本審評要點適用于基孔肯雅病毒核酸檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號）等相關(guān)法規(guī)的要求，同時建議參考《定性檢測體外診斷試劑分析性能評估注冊審查指導(dǎo)原則》、《體外診斷試劑主要原材料研究注冊審查指導(dǎo)原則》等適用的技術(shù)文件要求。

二、注冊審查要點

（一）產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)（如有）、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（2022年第8號）的要求編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

基孔肯雅核酸檢測試劑如有國家標(biāo)準(zhǔn)品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求，并使用國家標(biāo)準(zhǔn)品對三批產(chǎn)品進(jìn)行檢驗。

基孔肯雅病毒核酸檢測試劑的檢出限水平應(yīng)符合國家相關(guān)指南文件規(guī)定，申報產(chǎn)品對國家靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品（如有）的檢測結(jié)果應(yīng)與聲稱的檢出限水平相當(dāng)。

如有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)內(nèi)容應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

（二）分析性能研究

注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析結(jié)果等詳細(xì)資料。

如申報產(chǎn)品適用不同的機型，需要提交采用不同機型進(jìn)行性能評估的資料。如申報產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對各包裝規(guī)格進(jìn)行分析或驗證。

如果試劑同時適用于血清和血漿樣本類型，可選擇具有統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)量的樣本進(jìn)行不同樣本類型一致性的同源比對研究。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。

分析性能評估用樣本一般應(yīng)為真實樣本，如需稀釋，應(yīng)采用陰性樣本進(jìn)行稀釋。

建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1.樣本穩(wěn)定性

2.核酸（RNA）提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗證。

3.精密度

應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案進(jìn)行評價。精密度評價試驗應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得重復(fù)性、實驗室內(nèi)精密度、實驗室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中/強陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫螅纾?/p>

陰性樣本：待測物濃度為零濃度，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

4.分析特異性

4.1交叉反應(yīng)

4.1.1生物信息學(xué)分析

分析應(yīng)當(dāng)包括人基因組和其他近緣病毒、引起發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、出疹等相似癥狀的病原體。

4.1.2樣本驗證

采用滅活的臨床樣本或添加了滅活病原體培養(yǎng)物的陰性臨床樣本進(jìn)行驗證，樣本基質(zhì)應(yīng)與預(yù)期檢測樣本類型一致，交叉反應(yīng)研究用樣本主要考慮以下幾方面：

4.1.2.1發(fā)熱伴出疹相關(guān)病原體

登革病毒（DENV-1～DENV-4）、辛德畢斯病毒、蓋塔病毒、黃熱病毒、寨卡病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、乙型腦炎病毒*、水痘-帶狀皰疹病毒*、單純皰疹病毒*、細(xì)小病毒B19*、人類皰疹病毒 6*、人類皰疹病毒 7*、肺炎衣原體*、志賀氏菌*、淋球菌*、溶血性鏈球菌*、立克次體*。

注：“*”項為選擇性驗證的病原體，可在其中選擇不少于9個進(jìn)行驗證。

4.1.2.2可能在血液樣本中存在的其他常見病原體

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、人巨細(xì)胞病毒。

4.1.2.3高濃度人類基因組DNA

病毒培養(yǎng)液的濃度單位可采用TCID50或PFU/mL，細(xì)菌培養(yǎng)物濃度單位可采用CFU/mL。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細(xì)菌感染的水平為106 CFU/mL或更高，病毒為105 PFU/mL或更高，也可采用其他合理的方法對病原體濃度進(jìn)行定值，提交相關(guān)依據(jù)。

申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別信息和濃度確認(rèn)等試驗資料。

4.2干擾

4.2.1干擾物質(zhì)研究

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗證，驗證推薦物質(zhì)見表1。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行試驗，檢測包含臨界陽性水平在內(nèi)的基孔肯雅病毒樣本。對結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的Ct值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

4.2.2病原體干擾研究

應(yīng)充分考慮臨床上容易與基孔肯雅病毒合并感染的病原體（如登革病毒等）及“4.1.1”中經(jīng)生物信息學(xué)分析顯示存在較高同源性的病原體，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）基孔肯雅病毒核酸檢測的影響，進(jìn)行干擾研究。

5.檢出限

5.1檢出限的確定

建議采用至少3個樣本系列稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個濃度梯度重復(fù)檢測，記錄不同濃度檢出的結(jié)果，采用適當(dāng)?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit分析）和分析方法，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。

5.2檢出限的驗證

選擇另外3個不同來源的樣本在檢出限濃度水平進(jìn)行驗證，應(yīng)達(dá)到95%陽性檢出率。

如檢測試劑包括多個可單獨報告的檢測靶標(biāo)，應(yīng)分別進(jìn)行檢出限研究。

6.包容性

6.1應(yīng)當(dāng)采用生物信息學(xué)分析方法對產(chǎn)品檢測的包容性進(jìn)行研究，對所有已公布的基孔肯雅病毒核酸序列進(jìn)行序列比對分析，并對靶標(biāo)范圍內(nèi)的序列差異是否影響申報產(chǎn)品檢出能力進(jìn)行分析驗證。

6.2驗證至少10個不同來源的臨床陽性樣本。研究應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗證。

6.3基因型覆蓋

應(yīng)對基孔肯雅病毒主要基因型，包括西非型、東中南非型（包含印度洋分支）、亞洲型及其他流行變異株進(jìn)行包容性研究。研究可采用毒株或臨床樣本，如果樣本難以獲得，亦可采用假病毒。

7.企業(yè)參考品驗證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗并提供詳細(xì)的試驗數(shù)據(jù)。

（三）主要原材料研究

1.應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應(yīng)情況。提供檢測靶標(biāo)的詳細(xì)確定依據(jù)。

2.企業(yè)參考品制備

申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際情況自行設(shè)定企業(yè)參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品、精密度參考品。企業(yè)參考品應(yīng)采用臨床樣本或者使用病毒培養(yǎng)物加入陰性樣本制備，不宜采用質(zhì)粒、假病毒、基因組提取/純化物等核酸制備。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽性參考品應(yīng)包含不同濃度水平基孔肯雅病毒陽性滅活毒株或臨床樣本。

陰性參考品則主要涉及對特異性的驗證情況，建議至少包括登革病毒、麻疹病毒等相似癥狀病原體，生信分析顯示同源性較高的病原體和干擾樣本。

檢出限參考品應(yīng)包含95%陽性檢出水平或略高于檢出限水平的陽性滅活毒株或臨床樣本，如100%陽性檢出水平。

精密度參考品應(yīng)至少包含兩個濃度水平，其中包含弱陽性水平。

（四）其他

主要原材料研究的其他內(nèi)容、生產(chǎn)工藝、反應(yīng)體系、穩(wěn)定性、陽性判斷值等研究資料，可參考其他病原體核酸檢測試劑指導(dǎo)原則進(jìn)行研究。

（五）臨床評價

1.臨床試驗機構(gòu)

建議申請人在相關(guān)流行病學(xué)多發(fā)區(qū)域選擇臨床試驗機構(gòu)，應(yīng)是經(jīng)備案的醫(yī)療器械臨床試驗機構(gòu)（包括各級疾病預(yù)防控制中心）。臨床試驗機構(gòu)數(shù)量應(yīng)不少于3家，且具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個試驗中，試驗體外診斷試劑和對比方法/試劑均應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

2.臨床試驗設(shè)計

2.1 對于新的基孔肯雅病毒核酸檢測試劑

2.1.1 與臨床參考方法的比較

申請人可采用核酸序列測定方法（臨床參考方法）作為對比方法，驗證試驗體外診斷試劑檢測結(jié)果與核酸序列測定（如：一代測序）結(jié)果之間的一致性。

臨床試驗資料中應(yīng)對測序方法進(jìn)行詳細(xì)的介紹，并提交性能驗證數(shù)據(jù)，證明測序方法與試驗體外診斷試劑的可比性。同時，還應(yīng)提交測序引物和測序所擴增區(qū)段的生信分析資料，以確定測序區(qū)段對于基孔肯雅病毒核酸序列的特異性。

如測序試驗委托其他機構(gòu)完成，還應(yīng)提交由臨床試驗機構(gòu)委托第三方機構(gòu)/實驗室開展相關(guān)試驗的測序服務(wù)合同/協(xié)議。受托機構(gòu)/實驗室應(yīng)具有相應(yīng)檢測能力和資質(zhì)。

2.1.2 與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較

除上述比對試驗外，還應(yīng)考慮試驗體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比。臨床參考標(biāo)準(zhǔn)即按照相關(guān)管理部門發(fā)布的《基孔肯雅熱防控技術(shù)指南（2025年版）》和《基孔肯雅熱診斷衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T 590-2018）》文件進(jìn)行病例診斷的方法。  

2.2 對于已有同類產(chǎn)品上市的情形

如有已上市同類產(chǎn)品，臨床試驗可選擇已上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑，對比試劑的選擇應(yīng)考慮樣本類型、產(chǎn)品性能等方面與試驗體外診斷試劑具有良好的可比性。

申請人亦可以參照上述2.1部分進(jìn)行臨床試驗設(shè)計。

3.臨床試驗入組人群

臨床試驗的入組人群應(yīng)為產(chǎn)品的預(yù)期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群為基孔肯雅熱的疑似病例，申請人在進(jìn)行臨床試驗時應(yīng)依據(jù)相關(guān)管理部門發(fā)布的《基孔肯雅熱防控技術(shù)指南（2025年版）》和《基孔肯雅熱診斷衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T 590-2018）》文件中對“疑似病例”的定義入組病例。

另外，臨床試驗建議納入一定數(shù)量的弱陽性樣本。弱陽性樣本應(yīng)采用合理方法確定，一般將Ct值小于cutoff值3～5個Ct值的樣本定義為弱陽性樣本，應(yīng)采用對比試劑或臨床診療過程中所用的適當(dāng)?shù)姆椒ù_定弱陽性。

4.臨床試驗樣本類型

臨床樣本的采集建議按照《基孔肯雅熱防控技術(shù)指南（2025年版）》等文件進(jìn)行。

該類試劑可能涉及的樣本類型包括血清和血漿。針對血清和血漿樣本，如非臨床研究數(shù)據(jù)證明兩種樣本類型之間幾乎不存在差異，則臨床試驗中可將兩種樣本類型進(jìn)行匯總統(tǒng)計。

5.臨床試驗樣本量

與對比方法/試劑比較研究的臨床試驗樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行估算。臨床試驗可依據(jù)試驗體外診斷試劑相對于對比方法/試劑的陰陽性符合率分別估算最低陰陽性樣本例數(shù)。

臨床樣本量的估算建議采用如下樣本量公式計算，

公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評價指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為試驗體外診斷試劑評價指標(biāo)預(yù)期值。

其中，陰陽性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于90%。獲得臨床試驗數(shù)據(jù)后，證明產(chǎn)品相對于對比方法的陰陽性符合率（置信區(qū)間下限）不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）。當(dāng)評價指標(biāo)P接近100%時，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計學(xué)分析，如精確概率法等。

與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究，建議參考與對比方法/試劑比較研究部分的樣本量估算方法，并設(shè)定合理的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)。

6.臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析

臨床試驗結(jié)果一般以四格表的形式進(jìn)行總結(jié)，并據(jù)此計算試驗體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)比較時的靈敏度和特異度及其95%置信區(qū)間，或與對比方法/試劑比較時的陽性/陰性符合率及其95%置信區(qū)間。應(yīng)將試驗體外診斷試劑檢測結(jié)果與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的一致性、試驗體外診斷試劑與對比方法/試劑檢測結(jié)果一致性分別進(jìn)行統(tǒng)計分析。

臨床試驗報告中應(yīng)對入組受試者的基本情況進(jìn)行分析，包括受試者年齡、性別的分布情況，以及臨床診斷背景等，確認(rèn)入組樣本具有較好的代表性。

臨床試驗中所有不一致結(jié)果均應(yīng)結(jié)合患者的流行病學(xué)背景、臨床癥狀、臨床診斷以及疾病治療、轉(zhuǎn)歸等信息進(jìn)行充分的分析。臨床試驗結(jié)果應(yīng)能夠證明產(chǎn)品臨床性能滿足臨床要求。

7. 境外臨床試驗數(shù)據(jù)的認(rèn)可

境外臨床試驗數(shù)據(jù)應(yīng)符合《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗數(shù)據(jù)的注冊審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。提交完整的臨床試驗方案、報告和倫理審查意見，以及該數(shù)據(jù)適用于中國患者人群的論證資料、境內(nèi)外臨床試驗質(zhì)量管理差異的對比資料和臨床試驗質(zhì)量管理差異對于臨床試驗結(jié)果影響的論證資料。

注冊申請人應(yīng)根據(jù)上述臨床試驗技術(shù)審評要求，論證境外臨床試驗數(shù)據(jù)的充分性。

8. 臨床證據(jù)的形式要求

申請人應(yīng)按照《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等法規(guī)文件要求提交各機構(gòu)倫理審查意見、臨床試驗方案、臨床試驗小結(jié)、臨床試驗報告以及臨床試驗數(shù)據(jù)庫。

臨床試驗數(shù)據(jù)匯總表作為臨床試驗小結(jié)的附件提交。數(shù)據(jù)表中應(yīng)包括檢測病例的編號、年齡、性別、樣本類型、臨床診斷背景信息、試驗體外診斷試劑檢測結(jié)果（含各基因的Ct值）、對比方法/試劑的檢測結(jié)果（各基因的Ct值）和臨床診斷結(jié)果等。臨床應(yīng)用的數(shù)據(jù)集中每一病例編號應(yīng)能夠溯源。

（六）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式進(jìn)行標(biāo)注，并單獨列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。其中，有關(guān)說明書的【預(yù)期用途】建議如下：

本試劑盒用于體外定性檢測基孔肯雅熱病疑似病例、其他需要進(jìn)行基孔肯雅熱感染診斷或鑒別診斷者的xx樣本中基孔肯雅病毒核酸。

有關(guān)“疑似病例”等人群的定義參照《基孔肯雅熱防控技術(shù)指南》等文件執(zhí)行。

該產(chǎn)品在使用上應(yīng)當(dāng)遵守《基孔肯雅熱防控技術(shù)指南》等文件的相關(guān)要求。

開展基孔肯雅病毒核酸檢測，應(yīng)符合《基孔肯雅熱防控技術(shù)指南》等的要求，做好生物安全工作。

本試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。建議結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進(jìn)行綜合分析。